ChIP實(shí)驗原理：是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。
1. 細(xì)胞交聯(lián)（Crosslinking）
● 實(shí)驗?zāi)康模和ㄟ^甲醛交聯(lián)將蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合固定，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。
● 實(shí)驗步驟：向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入甲醛（通常濃度為1%），孵育10-15分鐘。加入甘氨酸終止交聯(lián)反應(yīng)。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌。
2. 細(xì)胞裂解（Cell Lysis）
● 實(shí)驗?zāi)康模毫呀饧?xì)胞，釋放染色質(zhì)。
● 實(shí)驗步驟：使用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解細(xì)胞。離心收集細(xì)胞核。
3. 染色質(zhì)打斷（Chromatin Shearing）
● 實(shí)驗?zāi)康模簩⑷旧|(zhì)打斷成200-1000 bp的片段，便于后續(xù)免疫沉淀。
● 實(shí)驗步驟：使用超聲儀將染色質(zhì)打斷。應(yīng)用酶解法，使用微球菌核酸酶（MNase）消化染色質(zhì)。
● 注意：打斷后需通過瓊脂糖凝膠電泳或生物分析儀檢測片段大小。
4. 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）
● 實(shí)驗?zāi)康模豪锰禺愋钥贵w捕獲目標(biāo)蛋白-DNA復(fù)合物。
● 實(shí)驗步驟：將染色質(zhì)片段與目標(biāo)蛋白的特異性抗體孵育（通常過夜）。加入Protein A/G磁珠或瓊脂糖珠，捕獲抗體-蛋白-DNA復(fù)合物。洗滌磁珠，去除非特異性結(jié)合。
5. 解交聯(lián)（Reverse Crosslinking）
● 實(shí)驗?zāi)康模横尫臘NA，便于后續(xù)分析。
●實(shí)驗步驟：加入含有蛋白酶K的解交聯(lián)緩沖液，65℃孵育數(shù)小時或過夜。加熱使蛋白質(zhì)變性，釋放DNA。
6. DNA純化（DNA Purification）
●實(shí)驗?zāi)康模杭兓疍NA，去除蛋白質(zhì)和RNA。
● 實(shí)驗步驟：使用酚-氯仿抽提或商業(yè)化的DNA純化試劑盒。通過乙醇沉淀或離心柱法回收DNA。
7. DNA分析（DNA Analysis）
● 實(shí)驗?zāi)康模簷z測目標(biāo)DNA片段。
●實(shí)驗步驟：定量檢測目標(biāo)DNA片段的富集程度。高通量測序分析全基因組范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。
ChIP實(shí)驗的關(guān)鍵點(diǎn)：
● 抗體特異性：抗體的質(zhì)量直接影響實(shí)驗結(jié)果，需選擇經(jīng)過驗證的高特異性抗體。
● 染色質(zhì)打斷：片段大小需控制在200-1000 bp，過大或過小都會影響免疫沉淀效率。
● 對照設(shè)置：包括Input對照、IgG對照等，確保實(shí)驗結(jié)果的可靠性。
ChIP實(shí)驗雖然步驟較多，但通過優(yōu)化條件和選擇合適的工具（如高效的DNA打斷儀），可以顯著提高實(shí)驗效率和成功率。
傳統(tǒng)的超聲打斷法存在諸多痛點(diǎn)：
● 操作繁瑣，耗時耗力：?需要反復(fù)摸索超聲條件，耗時長達(dá)數(shù)小時。
● 樣本損失大，重復(fù)性差：?超聲過程中容易產(chǎn)生熱量，導(dǎo)致樣本降解，實(shí)驗結(jié)果不穩(wěn)定。
● 難以處理微量樣本：?傳統(tǒng)方法對樣本量要求高，難以滿足微量樣本的實(shí)驗需求。
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非接觸超聲波DNA打斷儀：XM-26A（單槽）/XM-150A（雙槽）
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● 微量樣本，輕松應(yīng)對：可處理微量樣本，滿足各種實(shí)驗需求。
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